2.3 Pruebas bioquímica

- Prueba De La Catalasa.

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:

• Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
• Bacillus (+) de Clostridium (-).
• Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:

1. Método del portaobjetos (recomendado):

• Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
• Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H₂O₂ al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
• Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
• Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
• Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

2. Método del tubo de ensayo:

• Agregar 1ml de H₂O₂ al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado.
• Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.

 Resultado de la Prueba de Catalasa

Aparición de burbujas de O₂

- Prueba de Citrato

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

Resultado de la Prueba de Citrato

Medio de Color Azul

- Prueba de Fenilalamina Desaminasa

Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias

Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se añade 0,2ml de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.

Resultado De La prueba de Fenilalamina Desaminasa

Aparicion de color verde Oscuro 

 

- Prueba de Indol

Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante el enzima triptofanasa.

Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes:

• Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml
• p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g
• HCl (concentrado).........................................................................50ml

Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente a esta mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las más convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-).
Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva. Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retira de él asépticamente.

Resultado de la Prueba De Indol

Aparicion de un anillo rojo

- Prueba de Lactosa

Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminación fecal en análisis, sobre todo, de aguas. En bacteriología se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formación de gas a 35ºC en 48 horas". No se trata de un grupo taxonómico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayoría de ellas de origen intestinal.

Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, además de selectivo frente a bacterias no entéricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).

En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y sólo crecerán las enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarán productos ácidos que producirán un cambio de pH que se detectará gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rojo o violeta contrastando con la coloración amarillenta de las colonias lactosa (-).

 

Resultado de la Prueba de lactosa

Colonias de Color Violeta   

- Prueba de Manitol, Movilidad y Nitratos

Se incluyen en este apartado 3 pruebas bioquímicas debido a que se pueden realizar cultivando el microorganismo en un único medio, el Manitol Movilidad, que se prepara en tubo con agar recto y se siembra en picadura, incubándose a 37ºC durante 24 horas. También existe la posibilidad de hacer las pruebas en otros medios y por separado.

Prueba del Manitol

Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

Prueba de la Movilidad

Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles.

El medio manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser semisólido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar. En estas condiciones, las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario, las bacterias inmóviles permanecerán en la misma línea de la picadura en que se sembraron.

Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella (-) de las restantes que suelen ser movilidad (+).

Dentro del género Bacillus, nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especies generalmente (+).

Prueba de la reducción de nitratos

Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final.

Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros Haemophylus y Neisseria.

 

Resultado de la prueba de Manitol

Aparicion de color amarillo

Resultado de la prueva de Movilidad

Difusion a partir de la linea del inoculo

Resultado de la prueva de Nitrato

Cambio de color (rojo oscuro)

- Prueba de Oxidasa 

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asímismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno (ver prueba de la catalasa) que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para

• Identificar todas las especies de Neisseria (+)
• Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco intenso.

Realización de la prueba:

1. Método en placa directa

• Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla.
• Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

2. Método indirecto sobre papel

• Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.
• Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
• Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
• La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.

 Resultado de la Prueba de Oxidasa 
Aparicion de color azul                                            

-Prueba de Rojo de Metilo y Voges-Proskauer

Estas dos pruebas forman parte del IMVIC de las colimetrías y permiten la diferenciación dentro de las enterobacterias del grupo coli y aerógenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en dos fases: primero la metabolizarán aerobiamente (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizándola por vía anaerobia (fermentación). Ésta puede ser de dos tipos:

• Fermentación ácido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y succínico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.
• Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo aerógenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario que podrá ser detectada añadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de Voges-Proskauer) que reaccionarán con este compuesto produciendo un color rojo característico.
  

Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark y Lubs) y se incuba a 30ºC durante un periodo de 3 días como mínimo y 5 como máximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirán para cada uno de los ensayos.

• Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añade unas gotas (4-5) de solución indicadora de Rojo de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloración. Se considera positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo. Foto de los resultados de esta prueba
• Voges-Proskauer: A la otra porción de cultivo se le añade:

  0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etílico absoluto). El medio adquiere un aspecto lechoso. 0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente.

  Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-violáceo, más o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloración alguna.

 

 Resultado de la prueba de Rojo de metilo

 Aparicion de color rojo

- Prueba de Ureasa

Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.

Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.

Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación.

 Resultado de la rueba de Ureasa

Aparicion de color rojo

-Prueba de Gemacion de Levaduras

MATERIAL

Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Levadura

Agua azucarada Aguja enmangada Lactofenol-safranina

     TÉCNICA

1. Disolver con ayuda de una aguja enmangada un poco de levadura sobre un porta que contenga 2 o 3 gotas de agua ligeramente azucarada.
2. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio.
3. Repetir los pasos anteriores mezclando sobre el portaobjetos la suspensión acuosa de la levadura con una gota de lactofenol-safranina. Con este procedimiento se consigue una doble finalidad:
• Ver mejor las células de las levaduras, teñidas por la safranina.
• Retrasar un poco el desprendimiento de las células hijas gracias a la acción desfavorable del fenol para la vida normal de las levaduras.

   

Ejemplo de Levadura

 Resultado de la Gemacion de Levaduras

- Prueba de Observacion Microscopica de hongos

OBJETIVOS
Realizar preparaciones en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies de mohos. Observar la morfología de los hongos y distinguir entre hifas septadas y no septadas y entre distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan
MATERIAL
Microscopio Portaobjetos y cubreobjetos (22x22 mm) muy limpios y desengrasados con alcohol Aguja enmangada o lanceta	Trozo enmohecido de fruta o pan o un cultivo de hongos Solución de lactofenol al azul algodón Cinta adhesiva transparente

PREPARACIÓN EN FRESCO DE MOHOS

     TÉCNICA

1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa. Realizar la misma operación en otro portaobjetos que se usará para lavar la muestra.
2. Tomar el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o lancetas procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que realmente interesa, los conidióforos.
3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que será ya el definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas en su interior por los conidióforos), se aplastarán éstos ligeramente sobre la gota o se seccionarán con un bisturí.
4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede amontonado.
5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se formen burbujas entre los dos vidrios.

PREPARACIÓN EN CINTA ADHESIVA

     TÉCNICA

1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa.
2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm.
3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia puede haber una excesiva concentración de esporas.
4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos.
5. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro.
    
    Resultados
    
   
    
    Moho del Tomate
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
    Aspergillus
    
    
    
    
    
    
    
   
    
    Penicillum